高中教学仪器动物实验室安全防护与实施

　

生物安全相关法律、法规、规范：

《中华人民共和国传染病防治法》全国人大

《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2004

《人间传染的高致病性病原微生物实验室和实验活动生物安全审批管理办法》2006.8.15

《人间传染的病原微生物名录》2006.1.1

《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》2005.12.28

《传染病病人或疑似传染病病人尸体解剖查验规定》2005.4.30

《病原微生物实验室生物安全管理条例》2004.11.12

《卫生部、劳动和社会保障部关于保障接触病毒或细菌科研人员医疗服务有关问题的通知》2004.5.9

《实验室生物安全通用要求》(GB9489-2004)国家标准于2004年4月5日审定通过，2004年10月1日正式实施。2008年修订，目前实施的是《实验室生物安全通用要求》(GB 9489-2008)

该标准的发布是我国实验室安全管理、公共卫生体系建设以及认证认可体系建设具有里程碑意义的一件大事，它标志着我国实验室生物安全管理和实验室生物安全认可工作步入了科学、规范和发展的新阶段。

实验室生物安全组织体系：

实验室负责人为实验室生物安全的第一责任人；实验室负责人应当任命一名实验室生物安全负责人；指定专人监督检查实验室技术规范和操作规程的落实情况。

实验室生物安全负责人应为微生物学家或专业人员，有基础物理学、生物科学的技术背景，有与行政、技术、后勤的有效沟通协调。

实验室生物安全负责人的工作：

(1)生物安全、生物安全保障以及技术规章方面的咨询工作。

(2)就技术方法、程序和方案、生物因子、材料和设备进行定期的内部安全检查。

(3)与有关人员讨论违反生物安全方案或程序的情况。

(4)核实所有工作人员都接受了适当的生物安全培训。

(5)进行生物安全继续教育。

(6)对于所有牵涉到潜在感染性物质或有毒物品泄露等意外事故进行调查，并将调查结果以及处理意见向实验室主任和生物安全委员会报告。

(7)就可能的实验室感染与医务人员进行协调。

(8)在出现涉及感染性物质溢出或其他事故时，要确保清除了污染。

(9)确保废弃物的正确管理。

(10)确保对所有设备在修理或维护之前已经过适当的消毒处理。

(11)经常了解社区对卫生和环境问题的态度。

(12)要根据国家规定，针对病原体运入、运出实验室制订适当的程序。

(13)对所有涉及感染性物质研究工作的计划、方案以及操作程序，均要在具体操作实施以前进行生物安全审查。

(14)组织应急系统。

实验室生物安全管理体系文件：

以四层次划分为例：

安全管理手册：

对组织结构、人员岗位及职责、安全及安保要求、安全管理体系、体系文件架构等规定和描述。

安全要求不能低于国家和地方的相关规定及标准的要求。

应明确规定人员的权限和责任，保证遵守安全管理体系要求。

手册编制注意事项：

强调实验室设立单位的主要负责人对安全管理负总责；

批准页由设立单位的主要负责人签发。

实验活动相关的全过程：

记录：提供所完成活动的证据的文件，具可追溯性的文件，验证、预防措施和纠正措施的证据。

要求制定记录管理程序；

明确记录应包含：记录内容、要求、记录的档案管理、使用权限、记录的安全、保存期限等；

保证记录的真实、足够信息、可追溯性；

记录的更改规定及更改人签字、日期；

记录存储方式：纸质？电子文档？ 便于查阅、检索；

记录存放条件：盗窃？丢失？……

涉及病原微生物实验室生物安全法律法规与监督管理：

法律：中华人民共和国传染病防治法。

法规：病原微生物实验室生物安全管理条例、医疗废物管理条例。

规章：传染性非典型肺炎病毒的毒种保存、使用和感染动物模型的暂行管理办法、传染性非典型肺炎病毒研究实验室暂行管理办法、人间传染的病原微生物名录；

标准：《实验室生物安全通用要求》（GB19489-2008）、《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（WS233－2002）、《生物安全实验室建设技术规范》。

地方规范：上海市病原微生物实验室生物安全管理实施细则、上海市一、二级病原微生物实验室生物安全管理规范。

生物危害程度的分级：

根据对个体和群体的危害性分四级：

Ⅰ级：指危害性最低的病毒、细菌、真菌和寄生虫等生物因子；

Ⅱ级：指中等危害的生物因子，多为条件致病菌或机会致病菌；

Ⅲ级：指能引起个体的严重感染，但不易在人群中传播扩散的生物因子；可用抗生素治疗；

Ⅳ级：指能引起个体和群体严重感染，难治疗。

病原微生物危害程度分类主要依据：

微生物的致病性：致病性越强，导致的疾病越严重，其等级越高；微生物的传播方式和宿主范围。它们可能会受到当地人群已有的免疫水平、宿主群体的密度和流动、适宜媒介的存在以及环境卫生水平等因素的影响。

当地所具备的有效预防措施包括：通过接种疫苗或给予抗血清的预防（被动免疫）；卫生措施，例如食品和饮水的卫生；动物宿主或节肢动物媒介的控制。

当地所具备的有效治疗措施包括：被动免疫、暴露后接种疫苗以及使用抗生素、抗病毒药物和化学治疗药物，还应考虑出现耐药菌株的可能性。

临床微生物实验室及免疫学病原体筛检的防护标准应该是：

涉及动物的病原微生物实验：

动物实验室涉及病原微生物，需要考虑的因素包括：正常传播途径，使用的容量和浓度，接种途径，能否和以何种途径被排出。关于动物实验室中使用的动物，需要考虑的因素包括：动物的自然特性，亦即动物的攻击性和抓咬倾向性，自然存在的体内外寄生虫，易感的动物疾病，播散过敏原的可能性等。对使用野外捕捉的野生动物应考虑潜伏感染的可能性。

危险物品共分为九大类：

标准的BSL-2实验室除了满足BSL-1的要求以外，在门上增加了生物危险标志、II级生物安全柜。按国标（GB19489-2008）,还要配备高压蒸汽灭菌器、洗眼器。

BSL-1 实验室：无特殊要求；

BSL-2 实验室：配备高压灭菌设备，着专用工作服，带乳胶手套，生物安全柜(A2级)内操作。

BSL-2：必须强调对污染的针头或利器的使用要非常谨慎。

对易于通过气溶胶途径传播的微生物、具有增加工作人员暴露气溶胶或高度飞溅物的程序。

二级生物安全防护水平微生物操作必需在一级生物安全防护水平的基础之上，增加生物安全柜、高压灭菌器、安全离心机罩帽、防溅罩或面罩等。

实验室生物安全防护的基本原则：

安全设备和个体防护；实验室设计与建造的特殊要求；

安全操作规程；致病微生物及其毒素在实验室之间的传递；

管理制度；微生物危害评估。

实验室内务管理：

1）有内务管理的政策和程序，包括内务工作所用清洁剂和消毒灭菌剂的选择、配制、效期、使用方法、有效成分检测及消毒灭菌效果监测等政策和程序，应评估和避免消毒灭菌剂本身的风险。

2）不应在工作面放置过多的实验室耗材。

3）应时刻保持工作区整洁有序。

4）应指定专人使用经核准的方法和个体防护装备进行内务工作。

5）不应混用不同风险区的内务程序和装备。

6）应在安全处置后对被污染的区域和可能被污染的区域进行内务工作。

7）应制定日常清洁计划和清场消毒灭菌计划，实验室设备，工作表面。

8）指定专人监督内务工作，定期评价。

9）实验室的内务规程和所用材料发生改变时通知实验室负责人。

10）实验室规程、工作习惯或材料的改变可能对内务人员有潜在危险时，通知实验室负责人并书面告知内务管理负责人。

11）发生危险材料溢洒时，启用应急处理程序。

12) 相关记录安全保存。

实验室操作与技术：

工作时进出受约束或受限制；禁止吃、喝、吸烟；禁止用口移液；将溅洒和气溶胶减到最少；每天对工作面消毒；将废物消毒；保持对昆虫和啮齿类动物的控制。

入实验室：门禁，更衣，填写准出入实验室表。

查看实验室：仪器，试剂，标本，填写使用记录。

操作：防漏，防气溶胶，自身保护，遵守SOP。

废弃物处理：废物桶，废物袋，高压（指示物），登记。

出实验室：更衣，清洁，消毒，填写出入实验室表。

标识系统：

设置原则：安全、明确、醒目、便利、通用。

标识系统分四大类：警告标识、禁止标识、指令标识、提示标识。

用于标示危险区、警示、指示、证明等的图文标识是管理体系文件的一部分临时标识，如污染、消毒中、设备检修等。

标示出危险区，且应适用于相关的危险。

同时使用标识和物理屏障标示出危险区。

标示具体的危险材料、危险。

包括：生物危险、有毒有害、腐蚀性、辐射、刺伤、电击、易燃、易爆、高温、低温、强光、振动、噪声、动物咬伤、砸伤等；

同时提示必要的防护措施。

注明设备的可用状态、验证周期、下次验证或校准的时间等信息。

实验室入口处应有标识。

明确说明生物防护级别、操作的致病性生物因子、实验室负责人姓名、紧急联络方式和国际通用的生物危险符号；适用时，应同时注明其他危险。

实验室所有房间的出口和紧急撤离路线有指示。

在无照明的情况下也可清楚识别的标识。

所有管道和线路应有明确、醒目和易区分的标识。

所有操作开关应有明确的功能指示标识。

采取防止误操作或恶意操作的措施。

定期（至少每12个月一次）评审实验室标识系统。

及时更新，以确保其适用现有的危险。

国际生物危害警告标志：

生物安全实验室废物处置：

有危险废物处置程序，包括对排放标准及监测规定。

评估和避免危险废物处理和处置风险。

按相关标准分类处理和处置废物。

危险废物弃置于专门设计的、专用的和有标识容器内。

锐器（包括针头、小刀、金属和玻璃等）应直接弃置于耐扎的容器内。

由经过培训的人员处理危险废物，并应穿戴适当的个体防护装备。

应存放在指定的安全地方。

在实验室内消毒灭菌含活性高致病性生物因子的废物。

废弃物处理高压蒸汽灭菌器：

下排气灭菌器的装载量不得超过柜室内容量的80% ；预真空灭菌器的装载量不得超过柜室容积90%，且不得小于柜室容积的10%和5%。

必须将不同类物品装放在一起，则以最难达到灭菌物品所需的温度和时间为准。

物品装放时，上下左右相互间均应间隔一定距离以利蒸汽置换空气。

安全检查：

设施设备的功能和状态正常；

警报系统的功能和状态正常；

应急装备的功能及状态正常；

消防装备的功能及状态正常；

危险物品的使用及存放安全；

废物处理及处置的安全；

人员能力及健康状态符合工作要求；

安全计划实施正常；

实验室活动的运行状态正常；

不符合规定的工作及时得到纠正；

所需资源满足工作要求。

应急措施：

制定应急措施的政策和程序，包括：

生物性、化学性、物理性、放射性等紧急情况；

火灾、水灾、冰冻、地震、人为破坏等任何意外紧急情况；

保证使留下的空建筑物处于尽可能安全状态的措施；

应急程序至少包括：

负责人、组织、应急通讯；报告内容；个体防护和应对程序；应急设备；撤离计划和路线；污染源隔离和消毒灭菌；人员隔离和救治；现场隔离和控制；风险沟通。

使所有人员（包括来访者）熟悉：应急行动计划；撤离路线；紧急撤离的集合地点。

每年应至少组织所有实验室人员进行一次演习。

评估与演练：确保应急措施的针对性、科学性、持续有效性和充分性。

1级生物安全实验室溢出处理：

通知在这一区域的其他人预防污染。

穿戴手套、实验衣和面罩，用纸巾覆盖溢出物，把浓缩的消毒剂倒在溢出物区域周围并与溢出物混和，并维持适当的接触时间。

用镊子捡起一些玻璃碎片并放在生物危害高压灭菌袋内待净化后丢弃。

用皂液和消毒洗手液洗手。

II级生物安全实验室溢出：

迅速离开房间，避免吸入经空气传播的物质。通知其他的人离开。

关门并贴上警告标签。

移去污染的衣物，放在生物危害袋内。

用肥皂和水清洗所有暴露的皮肤。

报告转化所生物安全负责人，如果需要帮助，请咨询生物安全委员会。

在进入实验室所前，使气溶胶弥散至少30分钟。备齐处理物（消毒剂，纸巾，生物危害袋和镊子）。

穿上防护衣（实验外套，面罩，实验手套，必要时穿上长统靴）。按溢出物的状态，可以戴一个HEPA过滤呼吸罩以代替外科面罩。

用消毒湿巾覆盖污染区域，然后，小心地倒上消毒剂在溢出物的周围。避免扩大污染区域。因为要被溢出物稀释所以要用更浓缩的消毒剂。允许至少20分钟的接触反应时间。

用镊子捡起一些尖锐的物品丢弃在一个尖锐物存放器皿内，用消毒剂浸泡。

用消毒剂擦净溢出物可能飞溅到的周围区域。

用消毒剂浸泡溢出物，并放在一个生物危害袋内。

用10％家用漂白液喷雾这个区域和并空气干燥，或在接触反应10分钟后用消毒湿巾擦掉。

用消毒剂或抗菌皂和水清洗手和暴露的皮肤部分。

实验动物的护理和使用原则：

实验动物饲养和使用应遵守国家相关法律和规定

应明确使用实验动物的理由和目的

明确实验所使用动物的种类和数量，动物的数量应满足统计学的要求。

完善操作规程，避免或减轻因实验对动物造成的不适和痛苦。包括使用适当的镇静、镇痛或麻醉方法；禁止不必要的重复操作。

严格按程序实施实验后动物的处理，包括麻醉、止痛、实验后的护理或用麻醉方法处死。

实验过程中要求保证实验动物的良好生活条件，包括饲养环境、符合需求的饲料及细心的护理等。

研究人员和实验动物操作人员应接受实验动物的基本知识和操作技能等方面的培训。

使用过程中要求保证周围环境和实验人员的安全。

动物实验过程的行为规范：

1.物理限制：指在实验过程中包括检查、收集标本、给药、治疗或实验操作等，用手或工具限制动物活动的过程。

物理限制的主要原则和要求：

限制的工具不能作为常规的饲养工具。

工具的设计应合理，不要仅考虑实验的便利，主要考虑尽量减少动物的不适，避免伤害。

尽量减少限制的时间，以达到实验目的为基准。

在限制过程中，如果发生损伤或严重的行为改变，应暂停或禁止限制，并给予处理或治疗。

保证实验人员和周围人员的安全。

2.手术操作：有些实验需要对动物进行手术，即打开或刺穿动物的身体，对动物的身体或生理机能产生较大的损害，同时，实验人员也容易被血液/体液污染或被器械、针头刺伤，存在潜在生物污染的威胁，因此必须做到。

操作一定要使用适当的镇静、镇痛或麻醉方法。

禁止不必要的重复操作。

不提倡利用一个动物进行多个手术实验，但是，为充分利用动物资源，经动物伦理委员会许可，在可能的条件下可以实施。

严格实验操作规程，防止发生血液/体液外溅和针刺伤，避免生物污染。

手术后的动物、标本以及所用器具材料等必须按规定程序妥善处置。

3.饮食的限制：

实验用动物原则上要求随时饮食，如果一些实验需要动物限制食物或水的摄入量，应保证动物存活所需要的最低需求量。

4.废弃物和尸体处理：

1）血液和体液标本的处理

用于抗体、抗原、病原微生物、生化指标等检查的血液和体液，按照要求进行处理并检测，检测后的标本经121℃，30min高压消毒处理。

2）动物脏器组织的处理

动物器官组织，尤其是用于病原微生物分离的组织按照标准程序进行处理；用于病理切片的组织，均需要经过甲醛固定后再进行切片。剩余的组织经121℃，30min高压消毒处理。

3）动物尸体的处理

安乐处死后的动物尸体，取材完毕后，经121℃，30min高压灭菌处理后，集中送环保部门处理。动物生物安全三级（ABSL-3）实验室及以上级的实验室的感染动物尸体需经室内和双扉两道高压灭菌，才能移出实验室。

4）动物咽拭子的处理

用于病原分离和PCR检测的咽拭子，按照各自的要求处理后，进行病毒分离和PCR检测，剩余的标本经121℃，30min高压消毒处理。

5）病原分离培养物的处理

病原分离的培养物，不论是阳性还是阴性结果，均需经121℃，30min高压消毒处理。

实验动物使用程序和要求：

实验室如需要使用实验动物，应首先向生物安全和伦理委员会提出申请，填写申请表。

使用实验室得到认可后，根据申请表中申请的动物种属和数量，安排实验动物的饲养和使用。

实验动物必须在指定的区域内饲养和使用，禁止在实验室饲养动物。实验操作结束时，动物须返回指定的饲养区域内，不能在实验室内过夜。

动物实验应在实验室内指定的区域进行。

含有感染性材料的动物实验要求：

涉及感染性材料的操作要在生物安全柜中进行，并防止泄露在安全柜底面。操作包括感染动物的解剖、组织的取材、采血及动物的病原接种。

动物笼具在清洗前先做消毒处理。

污物、一次性物品需放入医疗废物专用垃圾袋中，经高压灭菌后方可拿出实验室。

动物尸体用双层医疗废物专用垃圾袋包裹后，放入标有动物尸体专用的容器中，用消毒液喷雾容器表面后，运至解剖区域剖检。

生物安全柜使用后应用消毒液擦拭、揩干。

废液需按比例倒入有消毒液的桶中，倒入时需沿容器壁轻倒并戴眼罩，防止溅入眼中。

如果有感染性物质溅到生物安全柜上、地上以及其他地方，应按菌，毒外溢在台面、地面和其他表面处理。

每天工作结束时，应用消毒液擦拭门把手和地面等表面区域。

废物放入高压灭菌器内时需同时粘贴指示条，物品移出前观察指示条是否达到灭菌要求。颜色不符时需重复高压灭菌。

高压灭菌器需每月做灭菌测试一次，并作记录。

小动物的饲养：

小动物主要指小鼠、大鼠、豚鼠等啮齿类动物，其饲养应遵循下列原则：

使用动物必须按国家标准或实验特殊要求检验合格，充分准备后进入系统，饲养人员应按实验设施规定程序要求进入系统。

及时观察动物饮食、精神状况，有无异常表现，患病或死亡。

动物应可自由进食、饮水。定期检查水、料是否充足并及时补给。同时保证其他饲养条件完备。

大动物饲养：

大动物主要指狗、猪及非人类灵长类动物等。

使用动物必须按国家标准或实验特殊要求，检验合格，充分准备后方可进入动物实验室。

应将每只动物日摄取总量分批次喂给，以保证动物的进食量和减少浪费。

应经常检查饮水装置，及时补充不足。

动物饲养区域应每天打扫，保持清洁，每周将地面消毒三次。

喂给瓜果、蔬菜等须洗净消毒。禁止喂给腐烂发霉不洁的食物，饮水要清洁。

对饲喂动物所用的小推车、食物、水容器等用品每周进行两次消毒。

室内光照，要求明暗各12h自动交替。

动物的检疫：

实验动物进入检疫室 在检疫室的缓冲间内，用75%酒精喷洒动物的外包装进行消毒，打开紫外灯照射10～15min。

将经上述处理的动物移入检疫室，根据要求进行检疫。

各动物的检疫期不同，大动物为2周，小动物为1周。

在检疫期内观察动物的精神状态、食欲、营养状况、排泄物等，如有任何异常，动物不得用于实验，应退出动物检疫室。

检疫合格的动物经适当处理后由缓冲间或物流通道进入动物实验室。

动物实验的有关操作：

1.给药：根据实验要求，按不同的动物，不同途径给药。灌胃和静脉注射。对接种了高致病性病原微生物的动物，尤其是大动物，将动物麻醉后方可进行灌胃或静脉注射。小动物灌胃或静脉注射可根据情况选择是否麻醉，静脉注射时需使用固定器。

2.采样：原则上活检时应对动物进行麻醉。对接种了病原体的大动物进行采血或体检时，要求将动物麻醉。对小动物进行灌胃、注射和采血时，可不麻醉动物，但要防止动物咬抓。

动物生物安全实验室设施与防护要求：

实验动物设施依其使用功能的不同，划分为各个功能区域，各自有不同的要求。实验动物环境设施分为三等，控制程度从低到高，依次为开放环境、隔离环境和屏障环境。

普通动物设施的区别：

动物房的建筑要求是避免外界微生物感染饲养的清洁级或SPF级动物，所以空气是外排的，而动物是清洁的。此时，进入实验室的工作人员反而可能作为传染源感染动物。

生物安全实验室的建筑理念则与之相反，在BSL-3实验室内的动物是不安全因素，要避免动物及其排泄物污染外界环境，所以BSL-3实验室内是负压，空气是向内流的。

动物设施的防护水平的实验操作和安全设备汇总：

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